О мечехвостах, нашей зависимости от их крови, и о том, как только что все поменялось

Это мечехвост. 

Одно из древнейших сохранившихся почти без изменений животных на планете. 

Мечехвосты настолько древние, что на их поведении ученые изучают поведение их родственников,  вымерших миллионы лет назад. А самих мечехвостов называют живыми ископаемыми.

В самом начале 20 века люди просто помешались на крови. В 1900 году австрийский врач Карл Ландштайнер впервые обнаружил существование разных групп крови и понеслась! Ученые бросились разглядывать в микроскопы и творить разные химические реакции не только с привычными организмами, но и с совершенно неочевидными. Добрались и до мечехвостов. И до их удивительной голубой крови! И заметили, что их кровь очень быстро свертывается в сгустки.

В 1908 году исследователи Карл Альсберг и Эрнест Кларк решили изучить этот механизм свертывания у мечехвостов. Химический состав сгустка вызывал у них недоумение. Он был практически нерастворим во всем, кроме самых едких щелочных растворов. Они провели несколько недель в лаборатории на берегу океана, изучая и проверяя. Выяснили, что кровь мечехвостов отличается от голубой крови других обладателей, от тех же осьминогов. 

Кстати, почему их кровь вообще голубая? У таких животных как мы кислород в крови переносят молекулы железа. Окисляясь, они и дают нашей крови красный цвет. А вот у моллюсков, мечехвостов и еще некоторых животных кислород в крови таскают на себе молекулы меди. Окисленная медь дает этот чудесный голубой цвет. В общем, вместо нашего гемоглобина, в их крови работает гемоцианин.

А еще Альсберг и Кларк установили, что самую главную роль в свертывании этой удивительной крови играет некий свертывающий белок.

Десять лет спустя другой исследователь по имени Карл Шмидт посмотрел на голубую кровь с другой стороны — кажется ее сворачивание имеет какой-то иммунологический механизм. 

Да уж, в те годы без интернета и скоростного обмена информацией скорость науки была невелика. Сегодня между такими шагами проходили бы от силы месяцы! 

В общем лишь через 30 лет после Шмидта за дело взялся американский патофизиолог Фредерик Бэнг. Принимаясь за работу он уже знал, что кровь мечехвостов сворачивается не по магии какой-то, а строго в местах повреждения животного и если в среде присутствовали бактерии. В своих экспериментах Бэнг наблюдал совсем поразительную штуку — кровь всего мечехвоста за несколько минут целиком превратилась в гель! Просто от контакта с бактериями!

Тогда Бэнг пошел дальше. Он культивировал в лаборатории грамотрицательные бактерии. 

Минуту важного пояснения про эти бактерии: у них необычная клеточная стенка, двойная.  Такая плохо проницаемая оболочка, внутренний слой которой состоит из липополисахаридов. Оно же называется эндотоксический слой. Мало того, что из-за этой двойной оболочки такие бактерии нашим организмам сложнее победить, так еще и эндотоксический слой для нас опасен сам по себе, даже с дохлой бактерией внутри. Попадание такой оболочки в нашу кровь вызывает мгновенный иммунный ответ, а за ним цитокиновый шторм. Температура тела быстро повышается, дыхание становится чаще, давление падает. В результате наступает токсический шок. И иногда его исход летальный. К грамотрицательным бактериям относятся такие злодейки как легионелла, хеликобактер, сальмонелла, клебсиелла и многие другие.

И вот Фред Бэнг вырастил в лаборатории такие бактерии (ученые так постоянно делают, это нормально). Затем ввел их в кровь мечехвоста — кровь за минуты превратилась в твердый гель. Тогда Бэнг прикончил бактерии и ввел другим мечехвостам уже мертвые бактерии — их кровь также превратилась в гель! Это было совершенно необычно!

Бэнг описал свою работу и переключился на другое исследование. А мечехвосты продолжали ждать своего звездного часа.

Прошло еще 10 лет, когда к Бэнгу присоединился молодой исследователь по фамилии Левин и они продолжили работу. Левин установил, что всю «работу» по обнаружению бактерий в крови мечехвостов выполняют амебоциты. Кто или что они такие?

В крови* некоторых беспозвоночных — таких как морские звезды, моллюски, губки — есть такие удивительные клетки — амебоциты. Их функции схожи с функциями наших белых кровяных телец, а назначение защищать организм от внешних вторжений.

А в крови атлантических мечехвостов (​​Limulus polyphemus) амебоциты совершенно особенные. Если их разрушить, то выделится необычное вещество — LAL —  Limulus amebocyte lysate. И Левин устновил, что именно это вещество детектирует эндотоксины — сворачивает кровь мечехвоста. Все еще пахнет какой-то скучной лабораторной наукой? А вот и нет! Левину пришло в голову КАК эту реакцию можно использовать для спасения людей.

Помните, что от попадания эндотоксина в нашу с вами кровь нам становится очень плохо? Поэтому просто крайне важно, чтобы любой препарат, который вводится в виде инъекций, не содержал не только никаких бактерий, но даже оболочек от сдохших при стерилизации бактерий. Да, это касается любого инъекционного препарата, будь то вакцина, антибиотик, обезболивающее, инсулин или даже физраствор!!

Поэтому на производстве таких препаратов есть тщательный контроль. Из каждой партии отбираются несколько образцов и тестируются. Но как? До открытия Левина и Бэнга для этого использовали кроликов. Кроликам вводили инъекционно эти образцы и дальше ждали 4-6 часов не разовьется ли у них лихорадка. Долго, дорого, не очень точно. А еще достаточно жестоко.

Так вот в 1960-х Левин разработал лабораторный тест на основе крови мечехвоста (а точнее того самого вещества LAL, выделяемого из нее). Тест был способен распознать эндотоксин в концентрации ОДИН К ТРИЛЛИОНУ! То есть одной крохотной частички LAL было достаточно на больший в триллион раз объем тестируемых веществ, чтобы в образце образовался видимый глазом сгусток. И это все всего за 45 минут!

Думаете это все! Тест оказался настолько крут, что показывал даже степень загрязнения тестируемой партии, что помогает установить на какой части производственной цепочки могла быть проблема. Чем больше степень загрязнения, тем быстрее образовывается сгусток.

Но самое главное — у мечехвоста можно взять лишь часть его крови. Не убивать само животное ради нее. Что поднимает степень гуманности теста еще выше в сравнении с методом с кроликами.

В 1977 году FDA приняла LAL тест как стандарт. А сегодня LAL тесты используются на всех этапах фарм-производства. Тестируют и саму тару, и компоненты будущего препарата, и препарат на конечной стадии. А еще шприцы, катетеры и все имплантируемые в тело устройства проходят этот тест. LAL тест используется по всему миру (да, российская фарма также использует LAL тест, спасибо моим помощницам в поиске и проверке этой информации). Кстати, кровь мечехвоста одна из самых дорогих в мире жидкостей! Всего 1 литр обойдется в примерно $15000.

Сегодня на базе стандартного визуального LAL теста придумали еще турбидиметрический (с использованием фотометрии) и хромогенный LAL тесты, которые подняли стандарты проверки качества еще выше! Поэтому сегодня введение инъекционных препаратов стало как никогда ранее безопасным. Но я все равно настоятельно рекомендую не спешить домой из больницы после введения любой инъекции, а провести минут 10-15 в коридоре с интересной книжкой или музыкой, оставаясь под присмотром врачей, пока микроскопическая опасность реакции минует.

А вот теперь поговорим о грустном. Во-первых, в мире есть нечистые на руку фермы мечехвостов. Они могут сливать у мечехвостов всю кровь, убивая их. Во-вторых, даже качественные фермы, с которыми работают мировые фарм-гиганты с хорошей репутацией, кто сливают лишь установленные как норма 30% крови, не могут гарантировать 100% выживаемость «доноров» после процедуры. По статистике около 10-15% мечехвостов (а некоторые эксперты настаивают на числе в 20-30%) погибают на воле, ослабленные после потери крови или в результате транспортировки от или к месту вылова. Ежегодно для целей фарм индустрии в мире вылавливается полмиллиона атлантических мечехвостов. А вместе с незаконным промыслом их на деликатесы у подпольных ресторанов, вместе с также незаконным отловом их для наживки при ловле некоторых морских обитателей, которых считают также деликатесами, объем вылова становится еще больше. 

Все это привело к резкому и уже почти трагическому сокращению популяции. Морские биологи предрекали это еще с момента открытия LAL эффекта и довольно долго удерживали напор медицинской индустрии в продвижении такого тестирования. Короче, за эти полвека мы привели к стадии вымирания животных, которые до этого жили на планете сотни миллионов лет и даже ленились эволюционировать.

Все стало еще хуже, когда случилась пандемия коронавируса. Миру разом потребовалось произвести такое количество вакцин, мед препаратов и просто расходников для инъекций, что итак огромный вылов мечехвостов достиг ужасающего размаха. 

И вообще-то плохо от этого не только мечехвостам — мы сами находимся в полной зависимости от их крови. Единственного в мире известного натурального вещества, обладающего такими свойствами. То есть, эгоистично истребив мечехвостов на свои нужды, мы спилим сук, на котором сидим.

Многие ученые понимали это уже давно. И первые разработки альтернатив крови мечехвоста начались еще в 1997 году. И знаете, кто снова пришел на помощь? Технологии ГМО! Гены природного биосенсора эндотоксинов (factor C) вычислили в геноме мечехвоста, выделили, клонировали и поместили в одноклеточные организмы, которые можно культивировать в специальной среде. Такие работы одновременно вели разные лаборатории и создали схожие варианты ГМ-микроорганизмов и тестов. Такая технология получила название rFC — рекомбинантный (то есть ГМ) фактор С.

К сожалению, процесс принятия регуляторами любой новой методики всегда очень длителен. Большая индустрия неповоротлива, иногда монополизирована (как лицензии на вылов мечехвостов для отдельных компаний) и обязана удостовериться в безопасности новых методов. Поэтому хотя rFC тесты разработаны и даже обкатаны за последние несколько лет, регуляторы требовали от фармы использования именно LAL тестов. Фарма могла использовать rFC на некоторых этапах контроля, но полностью отказаться от использования крови мечехвостов не имела права.

И вот тут в дело включились не только ученые, но и активисты. Первым выигранным боем стал подписанный осенью 2023 года запрет на вылов самок мечехвостов. Впереди был следующий бой. 26 июля 2024 года коалиция из 50 организаций, вставших на защиту мечехвостов, смогла добиться от фармакопеи Соединенных Штатов (главного регулятора) признания, что rFC «доказали свою безопасность, надежность и масштабируемость (в использовании)». С теплом добавлю, что мы с читателями внесли в это свой вклад, продвигая и подписывая петицию этой зимой 💚. В общем теперь фарма может официально полностью отказаться от крови мечехвостов! Что обязательно и сделает, так как это выгодно и им тоже. Остальные страны, как правило, подтягивают свои стандарты под стандарты США.

Слава мечехвостам, спасавшим нас так долго! Пришло наше время спасать их в ответ. И пусть у нас все получится не слишком поздно.

Дополнения:

Кстати, менее известно, но два родственника атлантического мечехвоста — китайский (японский) мечехвост и южный мечехвост — имеют схожее вещество — TAL (Tachypleus amebocyte lysate), со схожими свойствами. Поэтому в Азии фарма применяет в производстве уже его.

*У некоторых беспозвоночных в других телесных жидкостях

Для подготовки были использованы материалы: 👍https://www.aai.org/About/History/History-Articles-Keep-for-Hierarchy/Blue-Bloods-Bang,-Levin,-and-the-Horseshoe-Crabs (подробная история открытия, очень рекомендую к прочтению), а также https://www.aai.org/AAISite/media/About/History/Newsletters/AAI_History_Compendium_2024.pdf 

👍https://bigthink.com/health/horseshoe-crab-blood-clott/ (полное ярких подробностей описание тестов на кроликах и на мечехвостах, а также проблем связанных с выловом, смертностью и предлагаемые решения)

👍https://www.mat-biotech.com/lal-test (какие бывают современные варианты LAL теста)

👍https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/121766/the-impact-of-supply-chain-risks-and-lal-reliance/ (тут можно почитать про риски для индустрии)

👍https://earthjustice.org/press/2023/fisheries-commission-rejects-female-horseshoe-crab-harvest-proposal-for-delaware-bay — про запрет на вылов самок и как его добивались

👍https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.2006607 — тут подробно исследование безопасности и эффективности rFC

👍https://www.usp.org/news/expert-committee-approves-endotoxin-testing-using-non-animal-derived-reagents — официальное заявление USP (фармакопеи США)

👍https://reviverestore.org/usp-approves-endotoxin-testing-using-non-animal-derived-reagents/ — один из проектов-участников в продвижении новых стандартов, от которого мы подписывали петицию.